分子生物學平臺

新冠病毒核酸RT-PCR檢測

新冠病毒

新型冠狀病毒（嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2，Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2），最初發現于2019年，也可稱為2019新型冠狀病毒。是乙型冠狀病毒中的一個分型，與2003年SARS病毒相似。該病毒株以前從未在人體中發現，人感染后會出現呼吸道癥狀、咳嗽、發燒、呼吸困難，部分患者嗅覺味覺消失，嚴重的病例中出現嚴重的呼吸綜合征、肺炎、肺纖維化、腎衰竭，甚至死亡。該病毒主要通過上呼吸道入侵人體，主要感染肺、心臟、腎等多種器官。

該病毒具有包膜的、不分節段的正鏈單股RNA病毒，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約80～120nm。具有包膜的正鏈單鏈RNA病毒，較容易突變，目前多種變種在全球發現。

目前病毒檢測主要是核酸檢測和抗原檢測。核酸檢測在病毒感染后就可以檢測出，是檢測病毒感染與否的直接證據，抗原抗體檢測是患者感染3d后出現抗體，是檢測病毒感染的間接證據。

核酸檢測主要是通過實時熒光定量PCR檢測新冠病毒保守的片段區域的序列，以確定體內是否含有該病毒。當定量PCR檢測出有該序列，說明有可能感染了病毒，會通過多次PCR進行檢測并結合臨床檢測指標進行確診。

實時熒光定量PCR使用Taqman法進行檢測，使用針對病毒2個或更多的保守區域特異性引物和探針（不同國家或地區檢測的區域不一致，我國主要是檢測ORF1ab和N區域這2個保守區域）

圖1 新冠病毒基因組圖及PCR靶基因檢測區域

圖2 核酸檢測流程（據Enzolifesciences）

咽拭子樣本采集后運送至實驗室生物安全柜中直接進行下列處理，樣本也可以在4℃冰箱中儲存不超過7天。

（1）預處理：樣本中加入Remel Sputasol (Thermo Fisher Scientific)對粘性樣本進行預處理。

（2）病毒滅活：將50μl樣本在99℃加熱5min，將病毒滅活。將樣本轉移至離心機中4000rpm離心5min。（有的試劑盒需要提取核酸）

（3）逆轉錄+PCR檢測：取5μl樣本加入逆轉錄和PCR反應體系中。

反應體系包含：逆轉錄酶、DNA聚合酶、特異性引物、特異性probe，并使用乙肝病毒HBVS抗原序列作為內控。

PCR mix體系

PCR反應程序

（4）結果判讀：

PCR檢測結束后，定量PCR儀會有每個樣本檢測的Ct值，當檢測樣本兩個檢測位點無Ct值或者>38時，判斷為陰性，當兩個檢測位點Ct值<38時，是陽性，當兩個檢測位點Ct值在38左右不一致是，需要再次進行復檢。

當Ct值陽性時，醫生會結合流行病學接觸史和影像學檢查結合進行綜合判斷。

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