細胞生物學平臺

細胞三維（3D）培養

細胞在平面上生長是人為的和不自然的，因為這與細胞能夠以最佳狀態進行旺盛生長的體內環境并不相同。因此，傳統的2D單層細胞培養物很難恰當地反映出細胞的體內生長環境，進而可能造成細胞結構和組織功能的缺失。

三維（3D）細胞培養技術能夠更好地模擬生物體內細胞存活的自然環境，其自然條件可保持細胞間相互作用和更逼真的生化和生理反應。在3D環境中，細胞對內源性和外源性刺激（如溫度、pH、營養吸收、轉運和分化等方面的改變）應答更接近于它們在體內的反應。再生醫學的力量為理解發育、老化和組織年輕化等許多有趣的細胞進程提供了方法，了解生物學中這些有趣過程的唯一方法就是研究與生物體非常相似的模型系統，這使得3D細胞培養成為必不可少的研究工具。

3D細胞培養技術很多，但總結起來可以分為3類：

~3D水凝膠~
1.基本原理：
水凝膠是水膨脹性的高分子網絡，被設計用來模擬復雜的細胞外微環境。水凝膠由水、ECM蛋白和生長因子組成。用于三維細胞培養的第一代水凝膠是從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的ECM聚合物，新一代的合成、混合或基于多肽的材料則可以制備滿足特定需求的培養環境，為每個細胞和應用需求提供最合適的選擇

2.技術舉例：
2.1 天然水凝膠
ECM凝膠：從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的天然ECM，可以提供非常豐富的營養，與細胞的發育具有高度兼容性。ECM的主要組分是層粘連蛋白、IV型膠原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。這種水凝膠聚合物可通過20-40°C熱激活，凝膠化過程也是可逆的(蛋白質濃度:8–12mg/ml)。

MaxGel™ 胞外基質：MaxGel人細胞外基質源于體外培養的細胞基底膜，含有可預測的低水平內源生長因子，更適合需要更明確和特征再造BME的應用，最終可降低實驗的可變性。MaxGel人細胞外基質（ECM）含有多種細胞外基質成分，包括膠原蛋白、層粘蛋白、纖連蛋白、腱生蛋白、彈性蛋白以及大量的蛋白聚糖及粘多糖等。用于細胞培養的ECM可以高效地重現上皮細胞與間質在皮膚發育及器官型細胞培養過程中的協同作用。MaxGel™可以促進細胞生長和遷移，已被證實可以促進多種類型細胞的增殖，包括神經干細胞、神經細胞、神經膠質細胞。

Cultrex® 3-D培養工具： 3-D Culture MatrixTM RGF BME低生長因子基底膜抽提物，經過效果驗證，專為滿足三維培養研究的需求而研制。為了提供最標準化的3D培養基底膜抽提物產品，采用一套特殊工藝來降低生長因子以更好的保證批間一致性，并將基質的標準濃度控制在15 mg/ml左右，隨后在三維培養條件下對本品的效能進行評估驗證。

在3-D Culture Matrix™ RGF BME中培養16天后，對MCF-10A細胞進行染色：A）細胞染色試劑盒（結構）；B）SYBR®Green（細胞核）；C）MitoShift™（線粒體膜電位）； 3-D Culture Matrix™ RGF BME中培養12天后，對PC-3細胞進行染色：D）Calcein AM（細胞活力）；E）CPA染料1（細胞核）；F）Depsipher™（線粒體膜電位）

天然水凝膠技術優勢：
-建立已久，支持文獻和應用較多
-提供天然生物配體
-通常含有生長因子和細胞因子

2.2 合成水凝膠
HyStem™細胞培養支架— 首款定制合成的ECM
HyStem產品是首個可定制的合成ECM，與體內條件非常相近。使用HyStem 平臺，研究人員可控制生長因子、黏附因子和ECM 蛋白的摻入、水凝膠硬度及細胞囊化等。由于HyStem 是一種合成的基質，而不是生物提取物，所以研究人員能夠密切控制細胞環境的組成。HyStem 的成分包括化學合成的HyStem（巰基化透明質酸）、Extralink™（硫醇反應性交聯劑）、脫氣的水和生物純化的Gelin-S™（變性膠干細胞的天然環境富含透明質酸，因此，HyStem 試劑盒是培養干細胞的最佳選擇。HyStem 水凝膠支架精密模仿了天然的細胞外基質環境，含有豐富的透明質酸和膠原纖維，同時具有定制靈活性，能加入適當的生長因子、附著因子和蛋白。

Hystem可模擬天然的ECM結構

HydroMatrix™多肽水凝膠
HydroMatrix™水凝膠是一種合成多肽納米纖維支架，通過高度交聯的多肽水性凝膠中的天然三維結構來實現對合成基質的精確控制。HydroMatrix支架可以在溫度或離子強度變化刺激下從液態前體自組裝為高度交聯的三維多肽水性凝膠。通過調整HydroMatrix溶液的濃度，研究人員可以控制3-D結構的柔韌性，并對結構進行剪裁以滿足個人需求。HydroMatrix™可以促進細胞生長和遷移，已被證實可以促進多種類型細胞的增殖，包括神經干細胞、神經細胞、神經膠質細胞。

HydroMatrix多肽水凝膠可支持極佳的細胞生長環境。大鼠神經干細胞(NSCs)在3種平面上進行培養：NSCs在組織培養塑料平面生長很差(A)，在多聚賴氨酸/層粘蛋白處理的平面上長勢稍好(B)，但在0.5% (w/v)的HydroMatrix多肽水凝膠上表現出極佳的生長狀態(C)

合成水凝膠技術優勢:
-明確無動物源成分和病原物
-無生長因子，無批間差異
-可通過額外添加特異的生物相關氨基酸序列實現進一步功能化

~細胞聚集~
1.基本原理：
基于細胞聚集的方法不需要額外添加細胞外基質蛋白，細胞會產生內源的細胞外基質蛋白并不斷聚集形成較大的聚集體。由此形成的球體大小和組分取決于起始細胞數量、孵育時間和細胞增殖率等因素。

2.技術舉例：
2.1懸滴培養板
Perfecta3D®懸滴培養平板的孔板經過特殊設計，當在小孔上方加入一滴細胞懸液時，孔板的幾何構造就會引導細胞和培養基通過一個小洞，進而形成一個穩定的懸滴。滴入口位于每個培養孔的上方，可用來更換培養基，添加外源胞外基質、生長因子、小分子，也可用來加入細胞形成混合培養物。Perfecta3D®懸滴培養板每孔形成一個球體，且可控制球體大小以確保數據的穩定性。 96孔和384孔懸滴培養板與自動化液體處理設備、微孔板讀數儀等兼容。

懸滴培養板技術優勢：
-球體大小和數量可控制，孔間數據可重復
-可使用液體處理系統實現自動化
-使用較大球體可模擬缺氧狀態
-提供細胞混合的靈活性，種植前或球體形成后即可

2.2低粘附平面
Corning極低吸附平面是一種共價偶聯了水凝膠的親水不帶電平面，以盡可能的降低細胞貼附、蛋白吸收和酶活性，維持細胞以懸浮不貼壁的狀態生長。

低粘附培養平面技術優勢：
-可形成較大的球形體
-U型或V型底的96/384孔平板每孔可產生單個球體

2.3 3D Petri Dish
MicroTissues 3D 培養皿是不基于支架的天然3D 細胞培養環境，可最大限度模擬細胞間的相互作用和信號交流。該產品線包括多種規格的微組織培養系統，適配標準的12孔和24孔培養板，可應用于形成球狀體、乳腺癌細胞球、膠質瘤細胞球、肝細胞球、軟骨細胞球、骨細胞球、神經細胞球、心肌細胞球，以及細胞聚集體和擬胚體等多種細胞培養模式。

3D 培養皿制備流程圖

3D 培養皿技術優勢：
-單次移液操作即可獲得上百個相同大小的球體
-可從單細胞克隆形成球體
-可在同一平面對一組球體進行成像
-可形成復雜形態的微組織

~培養支架~
1.基本原理：
支架可提供一種物理支撐，細胞可以進入支架生長和行使功能?？紫斗植?、暴露平面區域和孔隙度具有關鍵作用，其數量和分布會影響細胞滲透入支架的效率，而依據不同的制作工藝，支架具有不同的結構、隨機或定制的孔隙分布。

支架可以通過包被或功能化以產生不同的特性和影響細胞的生長和行為，且有些“支架”技術還和“水凝膠”技術有著密切的關系。

2.技術舉例：
支架的種類很多，基本可以分為：1. 天然支架如膠原、明膠、纖維蛋白、幾丁聚糖、粘多糖、瓊脂糖和海藻酸等，天然支架具有生物兼容性，但穩定性較差；2. 合成支架如聚苯乙烯、聚己內酯、聚氨酯等，合成材料具有一致性、穩定性，但惰性、堅硬，生物兼容性較差

培養支架技術優勢：

-可實現器官型共培養-模擬分層的組織結構
-與現有的塑料制品格式和下游分析方法兼容
-結構一致具有可重復性，兼容高通量

小結：不同3D細胞培養技術都各有優勢和不足，因此在選擇合適的3D細胞培養系統時需要考慮多方面因素，比如要解決的問題或研究目的、實驗模型、細胞類型、技術可實現性、下游分析方法和樣品數量等。
 
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